人外周血淋巴細(xì)胞分離液

品牌：Solarbio | 貨號(hào)：P8610

產(chǎn)品簡(jiǎn)介： 本產(chǎn)品是一種用于分離人外周血淋巴細(xì)胞的無(wú)菌、低內(nèi)毒素水平的密度梯度分離液。其分離原理是根據(jù)血細(xì) 胞的密度差異（紅細(xì)胞和粒細(xì)胞密度為1.090 g/mL左右；淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞密度為1.075~1.090 g/mL；血小板為 1.030~1.035 g/mL），通過(guò)離心使一定密度的細(xì)胞按相應(yīng)密度梯度分布，從而將淋巴細(xì)胞從人外周血或臍帶血中分 離出來(lái)。

產(chǎn)品指標(biāo)：

密度                   1.077±0.001g/mL

滲透壓               290~350 mOsm/kg H2O

無(wú)菌                   0.1μm 濾膜過(guò)濾

保存條件： 

本產(chǎn)品對(duì)光敏感，應(yīng)該室溫避光儲(chǔ)存，保質(zhì)期 2 年。無(wú)菌開(kāi)封后，保存于室溫。

操作步驟：

1. 取新鮮抗凝全血（EDTA、枸櫞酸鈉或肝素抗凝均可）或者去纖維蛋白血液，用等體積的全血及組織稀釋液 或者PBS稀釋全血。

2. 在離心管中加入適量分離液（當(dāng)稀釋后血液體積小于3mL時(shí)，加入3mL分離液；大于等于3mL，加入等體積 分離液。但二者的總體積不能超過(guò)離心管的三分之二，否則會(huì)影響分離效果），將稀釋后的血液平鋪到分離 液液面上方，注意保持兩液面界面清晰。（可以使用巴氏德吸管吸取血液，然后將血液小心的平鋪于分離液 上，因?yàn)閮烧叩拿芏炔町?，將形成明顯的分層界面。如果樣品較多加樣時(shí)間較長(zhǎng)，在離心之前出現(xiàn)紅細(xì)胞成 團(tuán)下沉屬正?，F(xiàn)象。）

3. 室溫，水平轉(zhuǎn)子500~1000g，離心20~30min （血液的體積越大所需的離心力越大，離心 時(shí)間越長(zhǎng)，合適的分離條件需摸索，離心轉(zhuǎn) 速大不超過(guò)1200g）。

4. 離心后將出現(xiàn)明顯的分層：上層是稀釋的 血漿層，中間是透明的分離液層，血漿與分 離液之間的白膜層即為淋巴細(xì)胞層，離心管 底部是紅細(xì)胞與粒細(xì)胞。

5. 小心的吸取白膜層細(xì)胞到15mL潔凈的離心 管中， 10mL PBS或細(xì)胞洗滌液洗滌白膜層 細(xì)胞。250g，離心10min。

6. 棄上清，5mL的PBS或細(xì)胞清洗液重懸細(xì)胞，250g，離心10min。

7. 重復(fù)步驟6

8. 棄上清，細(xì)胞重懸備用。

分離純度： 

使用人淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞的分離純度大于90%。

注意事項(xiàng)：

A. 開(kāi)封前顛倒混勻，本分離液為無(wú)菌產(chǎn)品，為延長(zhǎng)分離液保存時(shí)間，請(qǐng)?jiān)跓o(wú)菌條件下啟封，避免微生物污染。。

B. 分離液使用時(shí)應(yīng)始終保持室溫（18℃~25℃），如室內(nèi)溫度較低，可將分離液預(yù)熱。4℃或者是溫度較低的條 件下離心，可能會(huì)導(dǎo)致白膜層中紅細(xì)胞污染加重。

C. 血液樣本推薦為新鮮抗凝血（采血2 h以?xún)?nèi)），為保持淋巴細(xì)胞的活性，應(yīng)避免冷凍和冷藏。

D. 稀釋血液或洗滌細(xì)胞，不可使用含Ca、Mg離子的緩沖液及培養(yǎng)液，其成分會(huì)導(dǎo)致血細(xì)胞凝集，大大降低細(xì)胞 得率及純度。

E. 部分塑料制品（如聚苯乙烯）因其帶有的靜電作用，可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞掛壁，影響分離效果。 F. 血液樣本的粘稠度或者是溫度差異，可能會(huì)影響分離效果，可以調(diào)節(jié)離心轉(zhuǎn)數(shù)和離心時(shí)間，摸索合適的分離 條件。

G. 吸取過(guò)多的淋巴細(xì)胞層及分離液層會(huì)導(dǎo)致分離液交界處的粒細(xì)胞被吸出從而使混雜的粒細(xì)胞數(shù)量增加；吸取 過(guò)多的血漿層可能會(huì)導(dǎo)致淋巴細(xì)胞中血漿蛋白及血小板污染。

H. 如果要進(jìn)一步對(duì)分離的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，那在收集血液和分離過(guò)程中，注意無(wú)菌操作，避免微生物污染。

I. 不同動(dòng)物血液在不同比重分離液中的細(xì)胞離散系數(shù)及細(xì)胞帶電不同，用戶(hù)在制定分離液時(shí)應(yīng)提供所需分離液 的比重、動(dòng)物種屬及被分離細(xì)胞的名稱(chēng)。

參考文獻(xiàn)

1. Boyum A. Separation of leucocytes from blood and bone marrow. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 1968; 97: 7.

2. Ting A, Morris PJ. A technique for lymphocyte preparation from stored heparinized blood. Vox Sang. 1971 Jun; 20(6): 561-3.

3. Boyum A. Separation of Blood Leucocytes, Granulocytes and Lymphocytes Tissue Antigens. 1974; 4(4): 269-74. 4. Weisbart RH, Webb WF, Bluestone R, Goldberg LS. A simplified method for lymphocyte separation. Vox Sang. 1972; 23(5): 478-80.

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