小鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA試劑盒

注意事項：※※※
1.試劑盒應(yīng)在有效期內(nèi)使用，請不要使用過期的試劑。
2.試劑盒未使用時應(yīng)保存在2-8℃冰箱，已復(fù)溶但未用完的標(biāo)準(zhǔn)品，請丟棄。
3.試劑盒使用前請在室溫恢復(fù)30 min，且充分混勻試劑盒里的各種成份及制備的樣品。
4.在試驗中標(biāo)準(zhǔn)品和樣本建議作復(fù)孔檢測，且加入試劑的順序應(yīng)保持*。
5.為避免交叉污染，請在試驗中使用1次性試管，槍頭，封板膜（※）及潔凈塑料容器。.
6.濃縮生物素化抗體和濃縮酶結(jié)合物的體積較少，在運輸過程中微量液體會沾到管壁及瓶 蓋上，使用前請離心處理（5-10 S即可），使管壁上的液體集中在管底部，取用時，請用移液器小心吹打幾次。
7.除了試劑盒中的濃縮洗滌液和終止液可以通用外，請不要使用其他來源試劑盒內(nèi)含的        試劑代替本試劑盒中的某單個組分。
8.為保證結(jié)果準(zhǔn)確，每次檢測均需做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

安全提示：

試劑盒中的終止液為酸性溶液，操作人員在使用時請帶上手套并注意防護(hù)；在操作過程中也要避免試劑接觸皮膚和眼睛，如果不慎接觸，請用大量清水清洗；檢測血液樣本及其它體液樣本時，請按國家生物實驗室安全防護(hù)有關(guān)管理規(guī)定執(zhí)行。

自備實驗器材（不提供，可代購）
1．酶標(biāo)儀（主波長450nm，參考波長630nm）
2．高精度移液器及一次性吸頭：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl
3．洗板機或洗瓶
4．37℃孵育箱
5．雙蒸水，去離子水，量筒等
6．稀釋用聚丙烯試管
 

小鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA試劑盒

樣本收集及儲存：
1.細(xì)胞培養(yǎng)上清：
將細(xì)胞培養(yǎng)基移無菌離心管，在4℃條件下1000×g離心10 min,然后將上清等量分裝于小EP管并于-20℃下保存（24小時內(nèi)檢測可放入2-8℃儲存），避免反復(fù)凍融。
2.血清樣本：
室溫血液自然凝固20 min后，在4℃條件下1000×g離心10 min，然后將上清等量分裝于小EP管并于-20℃下保存（24小時內(nèi)檢測可放入2-8℃儲存），保存過程中如有沉淀，請再次離心，避免反復(fù)凍融。
3.血漿樣本：
將全血收集到含抗血凝劑的管中，根據(jù)標(biāo)本的實際要求選擇EDTA，檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混合20 min，在4℃條件下1000×g離心10 min，然后將上清等量分裝于小EP管并于-20℃下保存（24小時內(nèi)檢測可放入2-8℃儲存），避免反復(fù)凍融。

※注意：

血清血漿樣本避免使用溶血、高血脂樣本，以免影響檢測結(jié)果；如果樣本中的靶標(biāo)物檢測濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品的值，請將樣品做適當(dāng)倍數(shù)稀釋后檢測，建議正式實驗前做預(yù)實驗以確定稀釋倍數(shù)。

 

小鼠腫瘤壞死因子α

試劑準(zhǔn)備：
1.試劑回溫：首先在實驗前30 min將試劑盒，待測樣本放置于室溫下，濃縮洗滌液如出現(xiàn)結(jié)晶，請放入37℃溫浴直到結(jié)晶全部溶解。
2.配制洗滌液：預(yù)先計算好稀釋后的洗滌液使用體積，然后用雙蒸水或去離子水將20倍濃縮洗滌液稀釋成1倍應(yīng)用液，未用完的濃縮洗滌液放入4℃冰箱保存。
3.標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋：加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣本稀釋液（SR1）1ml凍干標(biāo)準(zhǔn)品中，靜置15分鐘待其*溶解后輕輕混勻(濃度為2000pg/ml)，然后按照以下濃度：2000、1000、 500、 250、125、62.5、31.25、 0 pg/ml進(jìn)行稀釋。復(fù)溶過的標(biāo)準(zhǔn)品原液（2000pg/ml）未用完的應(yīng)廢棄或根據(jù)需要按照一次用量分裝，并將其貯存在-20～-80℃冰箱，具體如下圖。

4.生物素化抗體工作液：預(yù)先計算好試驗所需用量，用生物素化抗體稀釋液（SR2）將100倍抗體濃縮液稀釋成1倍應(yīng)用工作液（稀釋前充分混勻），請在30分鐘內(nèi)加入到反應(yīng)孔中。




5.酶結(jié)合物工作液：按每次試驗所需用量配制，用酶結(jié)合物稀釋液（SR3）將40倍濃縮酶結(jié)合物稀釋成1倍應(yīng)用工作液（稀釋前離心），請在30分鐘內(nèi)使用。



6.洗滌方法：
?自動洗板：甩盡酶標(biāo)板孔中液體，在厚迭吸水紙上拍干，注入洗滌液為300ul/孔,注與吸出間隔為30秒，洗板5次。
?手工洗板：甩盡酶標(biāo)板孔中液體，在厚迭吸水紙上拍干，用洗瓶加入洗滌液300ul/孔，靜止30秒后甩凈酶標(biāo)板孔中液體，在厚迭的吸水紙上拍干，洗板5次。
 

結(jié)果判斷：
1.用酶標(biāo)儀 450 nm 波長測定 OD 值。選擇雙波長檢測，參考波長為 630 nm。如不能進(jìn)行雙波長檢測，請用 450 nm 的OD測定值減去630 nm的OD測定值。
2.計算標(biāo)準(zhǔn)品、樣品的平均OD值：每個標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本的OD值應(yīng)減去零孔的OD值
3.以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度OD值為縱坐標(biāo)，用軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品中TNF-α含量可通過對應(yīng)OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度。
4.若標(biāo)本OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)做適當(dāng)稀釋后重新檢測，計算濃度時再乘以稀釋倍數(shù)。

TNF-αELISA KIT（Mouse）參數(shù)表征：

1. 數(shù)據(jù)及標(biāo)準(zhǔn)曲線

本圖僅供參考，應(yīng)以當(dāng)次試驗標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算小鼠TNF-α的樣本含量

2. 靈敏度：
低可檢測小鼠TNF-α濃度達(dá)15pg/ml，
20個零標(biāo)準(zhǔn)品濃度OD的平均值加上兩個標(biāo)準(zhǔn)差，計算相應(yīng)的可檢測濃度。

3. 特異性：
不與小鼠M-CSF 、GM-CSF、LIF、SCF、TNF-β、VEGF等反應(yīng)，人的TNF-α、TNF sRI、TNF sRII等反應(yīng)

4. 重復(fù)性：
板內(nèi)，板間變異系數(shù)<10%

5. 回收率：
在選取的健康小鼠血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入 3 個不同濃度水平的小鼠TNF-α，計算回收率。

6. 線性稀釋：
分別在選取的4 份健康小鼠血漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入高濃度小鼠 TNF-α，在標(biāo)準(zhǔn)曲線動力學(xué)范圍內(nèi)進(jìn)行稀釋，評估線性。

常見問題及解決方法：