果糖-1,6-二磷酸（FDP）含量檢測試劑盒說明書

微量法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。

貨號：BC2245

規(guī)格：100T/96S

產(chǎn)品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑二：臨用前取一支加入0.15 mL蒸餾水，充分溶解后待用，用不完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復凍融；

2、 標準品：臨用前加入1176 μL 蒸餾水充分溶解，配制成50 μmol/mL果糖-1,6-二磷酸標準溶液，2-8℃可以保存4周。

產(chǎn)品說明：

果糖1,6-二磷酸（fructose-1,6-diphosphate, FDP）是糖酵解過程中的一種重要的中間產(chǎn)物，對多種酶具有調(diào)節(jié)作用，具有改善細胞能量代謝、增加能量利用、抗心律失常及抗組織過氧化等作用，廣泛應用于臨床醫(yī)藥。

醛縮酶催化果糖1,6-二磷酸裂解，產(chǎn)物與2,4-二* 苯 肼在酸性介質(zhì)中反應生成2,4-二*苯腙，在堿性溶液中呈紅棕色，在540 nm處有特征吸收峰。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、低溫臺式離心機、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、微量玻璃比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器/細胞超聲破碎儀、冰、蒸餾水和EP管。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

組織：按照質(zhì)量（g）：提取液一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液一）加入提取液一，冰浴勻漿后于4℃，12000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無氣泡產(chǎn)生，4℃ 12000g離心10min后取上清待測。

細胞：按照細胞數(shù)量（10⁴個）：提取液一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL提取液一），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；于4℃，12000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無氣泡產(chǎn)生，4℃ 12000g離心10min后取上清待測。

血清（漿）等液體：取100μL液體加入1mL提取液一，4℃ 12000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無氣泡產(chǎn)生，4℃ 12000g離心10min后取上清待測。

注：提取液二需緩慢加入，加入后會產(chǎn)生大量氣泡，建議使用2mL EP管進行操作。

二、測定步驟

1、 分光光度計/酶標儀預熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至540nm，分光光度計蒸餾水調(diào)零。

2、 將50µmol/mL的果糖-1,6-二磷酸標準液用蒸餾水倍比稀釋為3.125、1.5625、0.78125、0.39、0.2、0.1 µmol/mL的標準溶液備用。

3、 標準品稀釋表：

實驗中每個標準管需40µL標準溶液。

4、 樣本測定：(在1.5 mL離心管或96孔板中操作)

三、FDA含量計算

1、 標準曲線的繪制：

以各個標準溶液的濃度為x軸，其對應的ΔA標準為y軸，繪制標準曲線，得到標準方程y= kx+b，將ΔA帶入方程得到x（µmol/mL）。

2、FDP含量的計算：

（1）按樣本質(zhì)量計算

FDP含量（µg/g 質(zhì)量）=x×(V上清+V提取液二)×M÷(W×V上清÷V提取液一)=403.75x÷W

（2）按細胞數(shù)量計算

FDP含量（µg/10⁴ cell）=x×(V上清+V提取液二)×M÷(V上清÷V提取液一×N)=403.75x÷N

（3）按液體體積計算

FDP含量（µg/mL）=x×（V上清+V提取液二）×M÷ [V液體×V上清÷（V提取液一+V液體）]=4441.25x

V上清：提取時上清液體積，0.8mL；V提取液二：提取液二的體積，0.15mL；V提取液一：提取液一的體積，1mL；W：樣本質(zhì)量，g；M：果糖-1,6-二磷酸分子質(zhì)量，340；V液體：液體樣本體積，0.1mL；N：細胞數(shù)量，以萬計。

注意事項：

當ΔA測定大于0.5時，建議將樣本用蒸餾水稀釋后再進行測定，計算公式中乘以稀釋倍數(shù)。

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