北京索萊寶科技有限公司
專注于生物學試劑及試劑盒領域
服務熱線：18101056239
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產品型號：BC4310-50T/24S
更新時間：2024-04-16
廠商性質：生產廠家
訪 問 量 ：1140
010-50973130
產品分類
蔗糖合成酶（分解方向；SS-I）活性檢測試劑盒說明書
可見分光光度法
貨號: BC4310
規(guī)格: 50T/24S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規(guī)格 | 保存條件 |
提取液 | 液體30 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑一 | 液體8 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑二 | 粉劑×1瓶 | -20℃保存 |
試劑三 | 液體8 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
標準品 | 粉劑×1支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、 試劑二：臨用前加入2.5 mL試劑一充分溶解待用，用不完的試劑建議分裝后，-20℃保存，避免反復凍融；
2、 標準品：20 mg果糖，臨用前加入1 mL蒸餾水溶解，配成20 mg/mL果糖溶液備用，2-8℃保存一周。
產品說明：
蔗糖合成酶（Sucrose Synthase，SS）是植物糖代謝過程的關鍵酶，負責催化蔗糖分解與合成的可逆反應，其分解活性可以催化蔗糖水解成UDPG與果糖， 參與淀粉、纖維素和半纖維素的合成等代謝途徑。
分解方向SS-I催化蔗糖和UDP生成果糖與UDPG，果糖與3,5 -二硝基水楊酸反應生成在540nm有特征吸收峰的棕紅色物質，通過測定540nm處吸光值變化可計算得SS-I活性。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計、臺式低溫離心機、水浴鍋、1mL玻璃比色皿、可調式移液槍、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水、EP管。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
組織：按照質量（g）：提取液體積（mL）為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴勻漿后于4℃，8000g，離心10min，取上清置于冰上待測。
二、測定步驟
1、 分光光度計預熱30min以上，調節(jié)波長至540nm，蒸餾水調零。
2、 將20mg/mL標準液用蒸餾水稀釋為5、4、3、2、1mg/mL的標準溶液備用。
3、 操作表 (在1.5mL離心管中操作) ：
試劑名稱（µL） | 對照管 | 測定管 | 標準管 | 空白管 |
樣本 | 20 | 20 | - | - |
標準溶液 | - | - | 20 | - |
蒸餾水 | - | - | - | 20 |
試劑一 | 80 | 80 | 80 | |
試劑二 | - | 80 | - | - |
混勻，30℃水浴30 min后，95℃水浴10 min（蓋緊，防止水分散失）。 | ||||
試劑三 | 100 | 100 | 100 | 100 |
混勻，沸水浴5 min（蓋緊，防止水分散失），冷卻至室溫。 | ||||
蒸餾水 | 800 | 800 | 800 | 800 |
混勻，置于1mL玻璃比色皿中，測定540nm處吸光值A，分別記為A對照管，A測定管，A標準管，A空白管。計算ΔA=A測定管-A對照管，ΔA標準=A標準管-A空白管。每個測定管需設一個對照管（標準曲線只需檢測1-2次）。 | ||||
三、SS-I活性計算
1、 標準曲線的繪制：
以各個標準溶液的濃度為x軸，其對應的ΔA標準為y軸，繪制標準曲線，得到標準方程y=kx+b，將ΔA帶入方程得到x（mg/mL）。
2、 SS-I活性的計算：
（1）按樣本蛋白濃度計算
酶活定義：每mg蛋白每分鐘分解蔗糖產生1µg果糖為1個酶活力單位。
SS-I酶活（U/mg prot）=x×V提取÷（V提取×Cpr）×103÷T = 33.33x÷Cpr
（2）按樣本質量計算
酶活定義：每g樣本每分鐘分解蔗糖產生1µg果糖為1個酶活力單位。
SS-I酶活（U/g質量）=x×V提取×103÷W÷T = 33.33x÷W
V提?。禾崛∫后w積，1mL；103：單位換算系數(shù)，1mg=103µg；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL，蛋白濃度自行測定；W：樣本質量，g；T：反應時間：30min。
注意事項：
1. 當A或ΔA超過1時，建議將樣本用提取液稀釋后再進行測定，計算公式中乘以稀釋倍數(shù)。
2. 95℃水浴時EP管蓋緊，防止水分散失，待冷卻至室溫后（建議每次實驗后冷卻時間保持一致），再進行下一步操作，避免液體飛濺燙傷以及影響試驗數(shù)據(jù)。
實驗實例：
1. 取0.1g黑麥草加入1mL提取液進行勻漿研磨，取上清后按照測定步驟操作，測得A對照管=0.128，A測定管=0.667，標準曲線y=0.1981x-0.0491，A空白管=0.014，計算ΔA=A測定管-A對照管=0.667-0.128=0.539，x=(0.539+0.0491) ÷0.1981=2.9687，按樣本質量計算酶活：
SS-I酶活（U/g質量）=33.33x÷W=33.33×2.9687÷0.1=989.4677 U/g質量。
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