外切β-1,4-葡聚糖酶/纖維二糖水解酶（C1）活性檢測試劑盒說明書

微量法

貨號：BC4305

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑一：臨用前取1瓶加入3 mL蒸餾水溶解備用，現(xiàn)用現(xiàn)配；2-8℃保存4周；

2、 標準品：5 μmol/mL 對硝基 苯* 溶液。

產(chǎn)品說明：

β-1,4-葡聚糖酶/纖維二糖水解酶（C1，EC3.2.1.91）存在于細菌、真菌和動物體內(nèi)，是微生物纖維素降解酶系的主要組分，也是水解天然纖維素的必需組分，C1酶作用于纖維素線狀分子的末端，水解β-葡萄糖苷鍵，每次切下1個纖維二糖分子。

C1能夠催化對*纖維二糖苷 (PNPC)生成對硝 基 苯*，后者在400 nm有特征光吸收。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、天平、臺式離心機、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、微量玻璃比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、EP管。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1、組織：按照組織質(zhì)量（g）: 提取液體積(mL)為1 : 5~10 的比例（建議稱取0.1 g 組織，加入1 mL提取液）進行冰浴勻漿。10000g，4℃離心10 min，取上清置冰上待測。

2、細菌、真菌：按照細菌或真菌數(shù)量10⁴個 : 提取液體積（mL）500~1000 : 1 的比例（建議500萬細菌或真菌加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率200W，超聲3 s，間隔7s，總時間3min）然后10000g，4℃，離心10 min，取上清置冰上待測。

3、血清（漿）等液體：直接測定。

二、測定步驟

1、 分光光度計/酶標儀預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長至400 nm，分光光度計蒸餾水調(diào)零。

2、 標準溶液的稀釋：取50μL 5 μmol/mL對硝 基 苯* 溶液，加入750μL蒸餾水，充分混勻，配制成0.3125 μmol/mL標準液使用，現(xiàn)用現(xiàn)配。（實驗中每管需要20μL，為減小實驗誤差，故配制大體積。）

3、 操作表（在1.5 mL離心管中依次加入下列試劑）：

    渦旋混勻后室溫放置2 min，吸取200 μL于微量玻璃比色皿或96孔板中測定400 nm下的的吸光度，分別記為A測定管、A對照管、A標準管、A空白管。計算ΔA測定=A測定管-A對照管，ΔA標準=A標準管-A空白管。每個測定管需設(shè)一個對照管。標準管和空白管只需測1-2次。

三、C1酶活計算

1、按照樣本蛋白濃度計算

酶活定義：每mg蛋白在反應(yīng)體系中每小時生成1 nmol對硝 基 苯*定義為一個酶活力單位。

C1 (U/mg prot) =ΔA測定÷（ΔA標準÷C標）×1000×V樣÷（Cpr×V樣）÷T=312.5×ΔA測定÷ΔA標準÷Cpr

2、按照樣本質(zhì)量計算

酶活定義：每g樣本在反應(yīng)體系中每小時生成1 nmol對硝 基 苯*定義為一個酶活力單位。

C1 (U/g 質(zhì)量)= ΔA測定÷（ΔA標準÷C標）×1000×V樣÷(V樣÷V樣總×W)÷T=312.5×ΔA測定÷ΔA標準÷W

3、按照細菌或真菌數(shù)量計算

酶活定義：每10⁴個細菌或真菌在反應(yīng)體系中每小時生成1 nmol對硝 基 苯*定義為一個酶活力單位。

C1 (U/10⁴ cell)= ΔA測定÷（ΔA標準÷C標）×1000×V樣÷（細菌或真菌數(shù)量×V 樣÷V樣總）÷T

=312.5×ΔA測定÷ΔA標準÷細菌或真菌數(shù)量

 4、按液體體積計算

酶活定義：每毫升液體在反應(yīng)體系中每小時催化生成1 nmol對 硝基 苯*為一個酶活力單位。

C1 (U/mL)= ΔA測定÷（ΔA標準÷C標）×1000×V樣÷V樣÷T=312.5×ΔA測定÷ΔA標準

C標：標準溶液濃度：0.3125 μmol/mL；V樣：加入的樣本體積，0.02 mL；V樣總：加入的提取液體積，1 mL；Cpr：上清液蛋白濃度，mg/mL；T：反應(yīng)時間，1 h；細菌或真菌數(shù)量：以萬計；W：樣本質(zhì)量，g；1000：換算系數(shù)，1 μmol=1000 nmol。

注意事項：

1、若吸光度大于1.5時，建議將樣本用提取液稀釋后進行測定。計算公式乘以稀釋倍數(shù)。

實驗實例：

1、 取0.1g香菇進行樣本處理，離心取上清稀釋2倍后按照測定步驟操作，測得計算ΔA測定=A測定管-A對照管=1.454-0.047=1.407，ΔA標準=A標準管-A空白管=0.292-0.047=0.245，根據(jù)樣本質(zhì)量計算酶活得：

C1（U/g 質(zhì)量）=312.5×ΔA測定÷ΔA標準÷W×2（稀釋倍數(shù)）=312.5×1.407÷0.245÷0.1×2=35893 U/g 質(zhì)量。

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