羅丹明標記鬼筆環(huán)肽 氨基酸與蛋白質(zhì)
貨號：CA1610
規(guī)格：300T
英文名稱 : TRITC Phalloidin 
別名 : 羅丹明鬼筆環(huán)肽 
分子式 : C60H70N12O13S2 
分子量 : 1231.4 
外觀（性狀） : 紫色粉末（凍干粉） 
單位 : 瓶

溶解性（Solubility）:溶于DMSO、DMF、甲醇或者乙腈水溶液（20%）
多肽序列（Sequence）:TRITC-bicyclic(Ala-DThr-Cys-cis-4-hydroxy-Pro-Ala-2-mercapto-Trp-4-hydroxy-5-amino-Leu)(S-3 to 6)

背景描述
    鬼筆環(huán)肽（Phalloidin）是一種來源于毒蕈類鬼筆鵝膏（Amanita phalloides）的環(huán)狀七肽毒素，以高親和力（Kd= 20 nM）選擇性結(jié)合于絲狀肌動蛋白F-actin，而不會與單體肌動蛋白G-actin結(jié)合，通常用來標記組織切片，細胞培養(yǎng)物或無細胞體系中的F-actin，從而對F-actin進行定性和定量分析。另外，鬼筆環(huán)肽衍生物也以相近的親和力結(jié)合于大小纖維，無論是動植物來源的肌肉細胞或非肌肉細胞，按照每一個肌動蛋白亞基約與一個鬼筆環(huán)肽分子的計量比結(jié)合。且非特異性結(jié)合幾乎可忽略，染色區(qū)域和非染色區(qū)域辨識度非常明顯。因此，鬼筆環(huán)肽衍生物特別適合替代肌動蛋白（Actin）抗體進行相關(guān)研究。另外鬼筆環(huán)肽衍生物很小，直徑約12-15?，分子量＜2000 Daltons，未標記肌動蛋白（Actin）的許多生理特性都得以維持，比如，同肌動蛋白結(jié)合蛋白如肌球蛋白，原肌球蛋白，DNase I等仍能發(fā)生反應；鬼筆環(huán)肽標記的纖維絲仍可穿透固相肌球蛋白基質(zhì)；以及甘油抽提的肌纖維標記后仍可收縮等。

    鬼筆環(huán)肽（Phalloidin）的結(jié)合阻止絲狀肌動蛋白（微絲）的解離，穩(wěn)定微絲結(jié)構(gòu)，從而破壞微絲的聚合-去聚合的動態(tài)平衡。此特性使得肌動蛋白聚合發(fā)生的臨界濃度（CC）降＜1μg/mL，因此，可用作一種聚合促進劑。此外，鬼筆環(huán)肽還可抑制F-actin的ATP水解活性。

    本品為TRITC（四甲基異硫氰酸羅丹明）標記的鬼筆環(huán)肽，染色反應特異性強，對比性高，具有比Actin抗體更好的染色效果，適合用作F-actin的定性和定量檢測。另外，經(jīng)本品結(jié)合后的F-actin仍能維持actin自身具有的許多生物學特性。且本品的結(jié)合沒有物種差異性，適用性廣泛。

    我司提供儲存液形式（貨號：CA1610，濃度為20μM）的TRITC標記鬼筆環(huán)肽，用戶根據(jù)自身需求選擇。建議使用濃度為80~200nM。

運輸與保存方法

    冰袋運輸。-20℃避光干燥保存， 1年有效。

注意事項

1）鬼筆環(huán)肽具有毒性，需小心操作（對人的半數(shù)致死劑量LD50約2mg/kg）。

2）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

需要自備材料

1）（可選）甲醇
2）1×PBS緩沖液, pH 7.4, 細胞培養(yǎng)（貨號：P1020）
3）固定液4%多聚甲醛（溶于PBS緩沖液）（貨號：P1110）
4）丙酮或透化液0.5% Triton X-100（溶于PBS緩沖液）
5）Fluoromount-GTM 水溶性封片劑（不含DAPI），DAPI
6）（可選）DAPI Fluoromount-GTM 水溶性封片劑（含DAPI）
7）（可選）BSA，標準
8）載玻片和蓋玻片
9）蓋玻片周圍密封液（如透明指甲油）
10）組裝有TRITC激發(fā)/發(fā)射濾片，以及DAPI激發(fā)/發(fā)射濾片的熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡

操作步驟

1. 工作液準備

    對于TRITC標記鬼筆環(huán)肽（貨號：CA1610，300T）

    本品以溶于甲醇的20μM儲存液形式提供，總量為300μl。按照100 nM的工作液濃度來換算，可制備總量為60 ml的工作液。建議收到產(chǎn)品后，根據(jù)單次使用量，對母液進行小量分裝，-20℃避光凍存，一年穩(wěn)定。

    開始實驗前，使用1×PBS緩沖液稀釋儲存液到需要的工作濃度。推薦工作濃度為：80~200nM。工作液現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.染色步驟

1）細胞爬片生長24h，使其密度達到50%匯合度。

2）吸掉培養(yǎng)液，37℃預熱的1×PBS（pH 7.4）清洗細胞2次。

3）使用溶于PBS的4%甲醛溶液進行細胞固定，室溫固定10min。

注意：避免固定劑中含有甲醇成分，因為甲醇在固定過程中可能破壞肌動蛋白。

4）室溫條件下，用PBS清洗細胞2~3次，每次10min。

5）室溫條件下，用丙酮（≤-20℃）脫水或者用0.5% Triton X-100溶液透化處理5min。

6）室溫條件下，用PBS清洗細胞2~3次，每次10min。

7）取200μl配制好的TRITC標記鬼筆環(huán)肽工作液，覆蓋住蓋玻片上的細胞，室溫避光孵育30min（通常情況下，4℃~37℃孵育皆可）。

注意：為了降低背景，可于TRITC標記的鬼筆環(huán)肽工作液內(nèi)加入1% BSA；另外，孵育過程中為了避免溶液揮發(fā)，可將蓋玻片轉(zhuǎn)移到一個密封的容器內(nèi)。

8）用PBS清洗蓋玻片3次，每次5min。

9）使用200μl DAPI溶液（濃度：100 nM）對細胞核進行復染，約30s。

10）用PBS清洗蓋玻片，然后倒置在已經(jīng)滴有一滴Fluoromount-GTM 水溶性封片劑的載玻片上。使用紙巾輕輕檫掉多余封片劑，然后用指甲油*封片。此法制備的標本玻片可置于4℃避光保存，通常6個月內(nèi)可繼續(xù)做F-actin染色分析。

注意：也可以直接使用含有DAPI的抗熒光淬滅封片劑（貨號：36308ES11）合并步驟9）10），簡化步驟。

11）熒光顯微鏡或者共聚焦顯微鏡下進行熒光觀察，選擇TRITC激發(fā)/發(fā)射濾片（Ex/Em=545/570nm）和DAPI激發(fā)/發(fā)射濾片（Ex/Em=364/454nm）。

 相關(guān)文獻：

《Strontium/adiponectin co-decoration modulates the osteogenic activity of nano-morphologic polyetheretherketone implant》 作者:Shengnan Wang，Yuanyi Yang，Yunfei Li，Jiacheng Shi，Jianshu Zhou，Li Zhang，Yi Deng，Weizhong Yang 期刊:Colloids and Surfaces B: Biointerfaces(2019)176,38-46 影響因子:3.997 PMID:30592990
《Halloysite nanotubes coated 3D printed PLA pattern for guiding human mesenchymal stem cells (hMSCs) orientation》 作者:FanWuJingqiZhengZhixiongLiMingxianLiu 期刊:Chemical Engineering Journal 影響因子:6.735 PMID:
《Enhanced adhesion and proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells on β?tricalcium phosphate modified by an affinity peptide》 作者:Guozong Wang Zhentao Man Hua Xin Yi Li Changshun Wu Shui Sun 期刊:Molecular Medicine Reports    Pages: 375-381 影響因子:1.922 PMID:30431109
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《Zoledronic acid inhibits osteoclast differentiation and function through the regulation of NF-κB and JNK signalling pathways》 作者:Xiao?Lin Huang， Lie?Yu Huang， Yu?Ting Cheng ，F(xiàn)ang Li ，Qian Zhou ，Chao Wu， Qian?Hui Shi， Zhi?Zhong Guan ，Jian Liao ，Wei Hong 期刊:International Journal of Molecular Medicine 影響因子:2.928 PMID:31173157
 

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