ATP含量檢測(cè)試劑盒（WST顯色法）說(shuō)明書(shū)

可見(jiàn)分光光度法

貨號(hào)：BC5470

規(guī)格：50T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1．提取液：低溫條件下，可能有結(jié)晶析出，放于60℃水浴加熱溶解即可，不影響使用；

2．試劑二：臨用前加入7 mL蒸餾水充分溶解，可加熱促進(jìn)溶解，用不完的試劑2-8℃保存4周；

3．試劑四：臨用前取1支加入0.2mL蒸餾水溶解，用不完的試劑-20℃分裝保存2周，避免反復(fù)凍融；

4．試劑五：臨用前加入3.2 mL蒸餾水充分溶解，用不完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復(fù)凍融；

5．試劑六：臨用前取1支加入0.25 mL蒸餾水備用，用不完的試劑-20℃分裝保存2周，避免反復(fù)凍融；

6．標(biāo)準(zhǔn)品：5 mg ATP。臨用前加入0.826 mL蒸餾水配成10 μmol/mL的ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液，用不完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復(fù)凍融；

7．0.3125μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：臨用前吸取20μL 10 μmol/mL的ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液和620μL蒸餾水混合配制成0.3125μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液，用于標(biāo)準(zhǔn)管的測(cè)定；

8．工作液的配制：臨用前請(qǐng)按試劑二：試劑三：試劑四：試劑五：試劑六=1mL：1mL：0.1mL：0.4mL：0.1mL的比例配制（2.6mL，約10T的量），現(xiàn)配現(xiàn)用。

產(chǎn)品說(shuō)明：

ATP廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是生物能量通貨，能荷是描述細(xì)胞能量代謝狀態(tài)的主要參數(shù)。測(cè)定ATP 含量并且計(jì)算能荷，能夠反映能量代謝狀態(tài)。

HK催化葡萄糖和ATP合成6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脫氫酶進(jìn)一步催化6-磷酸葡萄糖脫氫生成NADPH，WST-1 可與 NADPH 反應(yīng)，產(chǎn)生水溶性 formazan，在 450nm 下有特征吸收峰。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、低溫離心機(jī)、可調(diào)式移液槍、1mL玻璃比色皿、研缽/勻漿器/超聲波細(xì)胞破碎儀、蒸餾水、冰和氯仿。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1、 血清（漿）中ATP 的提取：按照血清（漿）體積（mL）：提取液體積（mL）為1：5~10 的比例（建議取約0.1mL 血清（漿），加入1mL 提取液）混合，充分震蕩，10000g，4℃離心10min；取上清液至另一EP 管中，加入500μL的氯仿充分震蕩混勻，10000g 4℃離心3min，取上清，置冰上待測(cè)（不可用于蛋白質(zhì)含量測(cè)定）。

2、 組織中ATP 的提取：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10 的比例（建議稱取約0.1g 組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿，10000g 4℃離心10min，取上清至另一EP 管中，加入500μL的氯仿充分震蕩混勻，10000g 4℃離心3min，取上清，置冰上待測(cè)（不可用于蛋白質(zhì)含量測(cè)定）。

3、 細(xì)胞或細(xì)菌中ATP 的提?。合仁占?xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，棄上清，按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1 的比例（建議500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎（冰浴，功率200W，超聲2s，停1s，總時(shí)間1min），10000g 4℃離心10min；取上清液至另一EP 管中，加入500μL的氯仿充分震蕩混勻，10000g 4℃離心3min，取上清，置冰上待測(cè)（不可用于蛋白質(zhì)含量測(cè)定）。

注：以上提取過(guò)程嚴(yán)格控制在冰浴條件下進(jìn)行。

二、測(cè)定步驟

1、 可見(jiàn)分光光度計(jì)預(yù)熱30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到450nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 試劑一置于37℃水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱中預(yù)熱15min以上。

3、 操作表：（按下表在1.5mLEP管中加入相應(yīng)試劑）

充分混勻，于1mL玻璃比色皿測(cè)定450nm處的吸光值，記為A測(cè)定、A標(biāo)準(zhǔn)、A空白，計(jì)算ΔA測(cè)定=A測(cè)定-A空白，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白（空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需做1-2次）。

三、ATP含量計(jì)算

1、 血清（漿）中ATP 含量計(jì)算

ATP含量(μmol/mL) = C標(biāo)準(zhǔn)×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×（V提取+V血清（漿））÷V血清（漿）

= 3.4375×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)

2. 按樣本質(zhì)量計(jì)算

ATP含量（μmol/g 質(zhì)量）= C標(biāo)準(zhǔn)×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×V提取÷W =0.3125×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W

3. 按蛋白濃度計(jì)算：

ATP含量（μmol/mg prot）= C標(biāo)準(zhǔn)×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×V樣本÷（V樣本×Cpr） =0.3125×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷Cpr

4. 按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

ATP含量(μmol/10⁴ cell）= C標(biāo)準(zhǔn)×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×V提取÷N = 0.3125×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷N

C標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，0.3125μmol/mL；V提取：加入的提取液體積，1mL；V血清（漿）：血清（漿）體積，0.1mL；V樣本：反應(yīng)體系中加入的樣本體積，0.1mL；W：樣本質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；N：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，按10⁴個(gè)。

注意事項(xiàng)：

1、 加入提取液離心后的上清若為渾濁為正?，F(xiàn)象。

2、 如果ΔA測(cè)定>1.5，建議將樣本用蒸餾水稀釋后進(jìn)行測(cè)定。注意計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)；如果吸光值過(guò)低或接近空白，建議統(tǒng)一放置于37℃水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h或更長(zhǎng)時(shí)間后再次測(cè)定，也可以加大樣本量后進(jìn)行測(cè)定，注意同步修改計(jì)算公式。

3、 提取液中含蛋白變性成分，若按蛋白濃度計(jì)算需要另取樣本重新計(jì)算。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1、 取0.108g小鼠腦加入1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿，10000g 4℃離心10min，取上清至另一EP管中，加入500μL的氯仿充分震蕩混勻，10000g 4℃離心3min，取上清，置冰上按照測(cè)定步驟操作，使用1mL玻璃比色皿測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定=0.283-0.154=0.129，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.569-0.154=0.415，按樣本質(zhì)量計(jì)算含量得：

ATP含量（μmol/g 質(zhì)量）=0.3125×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W=0.899μmol/g 質(zhì)量。

2、 取0.111g綠蘿葉片加入1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿，10000g 4℃離心10min，取上清至另一EP管中，加入500μL的氯仿充分震蕩混勻，10000g 4℃離心3min，取上清，置冰上按照測(cè)定步驟操作，使用1mL玻璃比色皿測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定=0.387-0.154=0.233，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.569-0.154=0.415，按樣本質(zhì)量計(jì)算含量得：

ATP含量（μmol/g 質(zhì)量）=0.3125×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W=1.58μmol/g 質(zhì)量。

參考文獻(xiàn)：

[1] Lin X, Wu Y, Chen X, et al. Determination of adenosine phosphate in tobacco leaf by UPLC with phenol-TEA pretreatment [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2014, 20(1): 26-31.

[2] Beutler E, Mathai C K. A comparison of normal red cell ATP levels as measured by the firefly system and the hexokinase system[J]. Blood, 1967, 30(3): 311-320.

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