線粒體乙醛脫氫酶（ALDH2）活性檢測試劑盒說明書

紫外分光光度法

貨號：BC5510

規(guī)格：50T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑二：臨用前取一瓶試劑二加入3mL蒸餾水溶解，用不完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復(fù)凍融；

2、 試劑五：沸點低，在使用時保持低溫以保證正確的吸取量。用后及時封口。

3、 工作液：臨用前根據(jù)樣本數(shù)量按照試劑一：試劑二：試劑三：試劑四：試劑五=550µL：100µL：20µL：30µL：100µL（800µL，1T）的比例配制工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

產(chǎn)品說明：

線粒體乙醛脫氫酶（aldehyde dehydrogenase 2，ALDH2）屬于乙醛脫氫酶蛋白家族，存在于很多組織，特別是肝臟組織內(nèi)含量較高。該酶主要參與乙醇代謝過程的第二步，在線粒體內(nèi)將乙醛氧化成羧酸，然后進(jìn)入三羧酸循環(huán)，被分解，解除乙醛對生物體的毒害作用。另外，ALDH2也可作為酯酶參與硝*油的代謝途徑，是硝*油重要的生物活性劑。

ALDH2催化乙醛和NAD⁺轉(zhuǎn)化為乙酸和NADH，利用NADH在340nm處吸光值的變化即可計算得到ALDH2的活性。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計、臺式離心機、分析天平、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、1mL石英比色皿、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 稱取約0.1g組織或收集500萬細(xì)胞，加入1mL提取液，在冰上用勻漿器或研缽進(jìn)行快速勻漿（勻漿器可上下研磨30次左右）。

2. 4℃ 600 g離心10min（如需獲得純度更高的線粒體，可將此步離心速度改為1000g）。

3. 將上清液移至另一離心管中，4℃ 11000 g離心15min，棄上清，留沉淀。

4. 在沉淀中加入400μL提取液，超聲波破碎（功率200W，超聲5秒，間隔10秒，重復(fù)15次），用于ALDH2活性測定，若用蛋白濃度計算，取20μL用于蛋白含量測定。

二、測定步驟

1、 紫外分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 工作液37℃預(yù)熱20min。

3、 操作表：

三、ALDH2酶活計算

1. 按蛋白濃度計算

酶活定義：每毫克蛋白每分鐘生成1nmol的NADH定義為1個酶活單位。

ALDH2活性（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反總÷（V樣×Cpr）÷T×F=26.795×ΔA÷Cpr×F

2. 按樣本質(zhì)量計算

酶活定義：每克樣本每分鐘生成1nmol的NADH定義為1個酶活單位。

ALDH2活性（U/g 質(zhì)量）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T×F =10.718×ΔA÷W×F

3. 按細(xì)胞數(shù)量計算

酶活定義：每10⁶個細(xì)胞每分鐘生成1nmol的NADH定義為1個酶活單位。

ALDH2活性（U/10⁶ cell）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反總÷（V樣÷V樣總×N）÷T×F =10.718×ΔA÷N×F

ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，1×10^-3L；V樣：反應(yīng)體系中加入樣本上清體積，0.2mL；V樣總：線粒體沉淀中加入提取液體積，0.4mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL，需自行測定；W：樣本質(zhì)量，g；N：細(xì)胞總數(shù)，以10⁶計；T：反應(yīng)時間，30min；10⁹：單位換算系數(shù)，1mol=10⁹nmol；F：稀釋倍數(shù)。

注意事項：

1、 試劑四有毒性，實驗過程中，請佩戴好防護(hù)用具。

2、 由于提取液中含有一定濃度的蛋白（約1mg/mL），所以在測定樣本蛋白濃度時需要減去提取液本身的蛋白含量（單獨測量）。

3、 樣本ΔA大于1時，建議將樣本用提取液稀釋后再進(jìn)行測定。當(dāng)ΔA小于0.01時，可以延長反應(yīng)時間（60min或更長）來測定。計算時注意同步更改計算公式。

實驗實例

1、 取0.1067g小鼠肝臟進(jìn)行樣本處理，用提取液稀釋4倍后，按照測定步驟操作，用1mL石英比色皿測得計算ΔA測定=A2測定-A1測定=1.271-0.282=0.989，ΔA空白=A2空白-A1空白=0.115-0.115=0，ΔA=ΔA測定-ΔA空白=0.989-0=0.989，按樣本質(zhì)量計算酶活得：

ALDH2活性（U/g質(zhì)量）=10.718×0.989÷0.1067×4=397.380 U/g質(zhì)量。

2、 取0.1069g冬棗果肉進(jìn)行處理，按照測定步驟操作，用1mL石英比色皿測得計算ΔA測定=A2測定-A1測定=0.267-0.162=0.105，ΔA空白=A2空白-A1空白=0.115-0.115=0，ΔA=ΔA測定-ΔA空白=0.105-0=0.105，按樣本質(zhì)量計算酶活得：

ALDH2活性（U/g質(zhì)量）=10.718×0.105÷0.1069=10.528 U/g質(zhì)量。

3、 取8×10⁶個細(xì)胞進(jìn)行樣本處理，按照測定步驟操作，用1mL石英比色皿測得計算ΔA測定=A2測定-A1測定=0.249-0.154=0.095，ΔA空白=A2空白-A1空白=0.115-0.115=0，ΔA=ΔA測定-ΔA空白=0.095-0=0.095，按細(xì)胞數(shù)量計算酶活得：

ALDH2活性（U/10⁶ cell）=10.718×0.095÷8=0.127 U/10⁶ cell。

參考文獻(xiàn)：

[1] Feng Liu, Xiangqin Cui, Harry Horner, et al. Mitochondrial aldehyde dehydrogenase activity is required for male fertility in maize. The Plant Cell. May 2001, 13:1063-1078

[2] Ying Hu, Jinbin Yin, Mingzhi Zheng, et al. Mitochondrial aldehyde dehydrogenase activity protects against lipopolysaccharideinduced cardiac dysfunction in rats. Molecular Medicine Reports. February 2015, 11:1509-1515

[3] Amit Joshi, Lauren Wassenhove, Kelsey Logas, et al. Aldehyde dehydrogenase 2 activity and aldehydic load contribute to neuroinflammation and Alzheimer’s disease related pathology. Acta Neuropathologica Communications. December 2019, 7:190

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