超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測試劑盒（WST-1法）說明書

微量法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動，請注意并嚴(yán)格按照該說明書操作。

貨號：BC5165

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑二：使用前先使用掌上離心機(jī)離心至管底再吹打混勻；

2、 試劑二工作液：根據(jù)樣本數(shù)量按試劑二：蒸餾水=5μL：245μL（共250μL，約12S）的比例配制試劑二工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配；

3、 試劑四工作液：根據(jù)樣本量按試劑四：蒸餾水=20μL：180μL（共200μL，約20T）的比例配制試劑四工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

產(chǎn)品說明：

SOD（EC 1.15.1.1）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，催化超氧化物陰離子發(fā)生歧化作用，生成H₂O₂和O₂。SOD不僅是超氧化物陰離子清除酶，也是H₂O₂主要生成酶，在生物抗氧化系統(tǒng)中具有重要作用。

通過黃*呤及黃*呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子(O₂^-)，O₂^-可與WST-1反應(yīng)生成水溶性黃色甲臜，后者在450nm處有吸收峰；SOD可清除O₂^-，從而抑制了甲臜的形成；反應(yīng)液黃色越深，說明SOD活性愈低，反之活性越高。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺式離心機(jī)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、電子天平、可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞樣本：收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清，按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）=500-1000:1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液）超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次），8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2. 組織樣本：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積（mL）為1:5-10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

3. 血清（漿）樣本：直接檢測，若有渾濁可離心后取上清進(jìn)行測定。

二、測定步驟

1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至450nm，分光光度計(jì)蒸餾水調(diào)零。

2. 測定前將試劑一、試劑三和試劑四工作液37℃水浴5min以上。

3. 加樣表（按順序在EP管或96孔板中加入下列試劑）

充分混勻，37℃水浴30min后，450nm處測定各管吸光值A。分別記為A測定、A對照、A1空白、A2空白，計(jì)算ΔA測定=A測定-A對照，ΔA空白=A1空白-A2空白。（空白管1和空白管2各只需做1~2管；每個樣本有一個對照管）

三、SOD活性計(jì)算

1、抑制百分率的計(jì)算

抑制百分率=(ΔA空白-ΔA測定) ÷ΔA空白×100%

盡量使樣本的抑制百分率在30-70%范圍內(nèi)，越靠近50%越準(zhǔn)確。如果計(jì)算出來的抑制百分率小于30%或大于70%，則通常需要調(diào)整加樣量后重新測定。如果測定出來的抑制百分率偏高，則需適當(dāng)稀釋樣本；如果測定出來的抑制百分率偏低，則需重新準(zhǔn)備濃度比較高的待測樣本或者提高加樣表中的樣本量，但需相應(yīng)減少測定管和對照管中蒸餾水的體積。

2、SOD酶活性單位：在上述黃*呤氧化酶偶聯(lián)反應(yīng)體系中抑制百分率為50%時(shí)，反應(yīng)體系中的SOD酶活力定義為一個酶活力單位。

3、SOD酶活性計(jì)算：

（1）血清（漿）SOD活性（U/mL）=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V反總] ÷V樣×F

=10×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ×F

（2）組織、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞SOD活力計(jì)算：

a.按樣本蛋白濃度計(jì)算

SOD活性（U/mg prot）=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V反總] ÷(V樣×Cpr)×F

=10×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ÷Cpr×F

b.按樣本質(zhì)量計(jì)算

SOD活性（U/g 質(zhì)量）=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V反總] ÷(W×V樣÷V樣總)×F

=10×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ÷W×F

c.按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

SOD 活力（U/10⁴ cell）=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V反總] ÷(N×V樣÷V樣總)×F

=10×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ÷N×F

V反總：反應(yīng)總體積，0.2mL；V樣：加入反應(yīng)體系中的樣本體積，0.02mL；V樣總：加入提取液體積1mL；Cpr：蛋白樣本濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；N：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，以10⁴計(jì)；F：樣本稀釋倍數(shù)。

注意事項(xiàng)：

1、 樣本和試劑二工作液使用時(shí)在冰上放置。

2、 樣本較多時(shí)，可按表格配制測定管工作液和對照管工作液（包含試劑一、（試劑二工作液）、試劑三、蒸餾水），試劑四工作液必須最后加入。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1、 取0.1g大鼠肝臟加入1mL提取液進(jìn)行勻漿研磨，取上清稀釋50倍，按照測定步驟操作，用96孔板測得計(jì)算ΔA測定= A測定-A對照=0.419-0.047=0.372，ΔA空白=A1空白-A2空白=0.752-0.045=0.707，抑制百分率=(ΔA空白-ΔA測定) ÷ΔA空白×100%=47.38%，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：

SOD活性（U/g 質(zhì)量）=10×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ÷W×F =4502.09 U/g 質(zhì)量。

2、 取0.1g綠蘿葉片加入1mL提取液進(jìn)行勻漿研磨，取上清稀釋3倍，按照測定步驟操作，用96孔板測得計(jì)算ΔA測定= A測定-A對照=0.417-0.108=0.309，ΔA空白=A1空白-A2空白=0.752-0.045=0.707，抑制百分率=(ΔA空白-ΔA測定) ÷ΔA空白×100%=56.29%，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：

SOD活性（U/g 質(zhì)量）=10×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ÷W×F =386.34 U/g 質(zhì)量。

3、 450×10⁴個Hela細(xì)胞，加入1mL提取液進(jìn)行勻漿研磨，取上清按照測定步驟操作，用96孔板測得計(jì)算ΔA測定= A測定-A對照=0.417-0.053=0.364，ΔA空白=A1空白-A2空白=0.752-0.045=0.707，抑制百分率=(ΔA空白-ΔA測定) ÷ΔA空白×100%=48.51%，按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算酶活得：

SOD活性（U/10⁴ cell）=10×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ÷N×F =0.021 U/10⁴ cell。

4、 取50μL人血清按照測定步驟操作（同時(shí)減少加樣表中蒸餾水體積），用96孔板測得計(jì)算ΔA測定= A測定-A對照=0.889-0.418=0.471，ΔA空白=A1空白-A2空白=0.752-0.045=0.707，抑制百分率=(ΔA空白-ΔA測定) ÷ΔA空白×100%=33.38%，按血清（漿）體積計(jì)算酶活得：

血清（漿）SOD活性（U/mL）=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V反總] ÷V樣×F =2.004 U/mL

參考文獻(xiàn)：

[1] Peskin A V, Winterbourn C C. A microtiter plate assay for superoxide dismutase using a water-soluble tetrazolium salt (WST-1) [J]. Clinica chimica acta, 2000, 293(1-2):157-166.

[2] Hou Z, Zhao L, Wang Y, et al. Purification and characterization of superoxide dismutases from sea buckthorn and chestnut rose[J]. Journal of food science, 2019, 84(4): 746-753.

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