小分子化合物抑制劑已成為藥物研發(fā)、靶點(diǎn)驗(yàn)證以及機(jī)制性細(xì)胞生物學(xué)中不可-或缺的工具。它們能夠以時間上的精確性調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的功能，這相較于基因方法具有優(yōu)勢。然而，一個長期存在且常常被低估的問題威脅著無數(shù)研究的準(zhǔn)確性——脫靶效應(yīng)。

脫靶效應(yīng)指的是小分子與除其主要預(yù)期靶點(diǎn)之外的其他蛋白質(zhì)發(fā)生意外的相互作用。這些相互作用可能會產(chǎn)生混亂的數(shù)據(jù)、假陽性表型，并最終導(dǎo)致不可重復(fù)的結(jié)果。接下來將詳細(xì)介紹脫靶效應(yīng)為何會發(fā)生、如何檢測它們，以及最重要的是如何利用實(shí)用的實(shí)驗(yàn)策略和已充分表征的工具化合物來控制它們。

在實(shí)驗(yàn)研究中，可靠的結(jié)果不僅取決于化合物本身，還取決于試劑的質(zhì)量、驗(yàn)證方法以及實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的支持。這就是Solarbio所發(fā)揮價值的地方。憑借在小分子化合物及靶點(diǎn)驗(yàn)證服務(wù)方面的豐富經(jīng)驗(yàn)，Solarbio為研究人員提供幫助，助力他們獲取更清晰的數(shù)據(jù)，并在篩選和驗(yàn)證過程中減少未知變量的影響。

導(dǎo)致脫靶效應(yīng)原因是什么？

了解脫靶效應(yīng)原因是減輕這種效應(yīng)的第一步。

1.小分子化合物抑制劑的多靶點(diǎn)作用

許多小分子化合物抑制劑，尤其是激酶抑制劑，具有內(nèi)在的多靶點(diǎn)特性——即能夠與多個靶點(diǎn)結(jié)合。激酶具有高度保守的 ATP 結(jié)合口袋，這使得選擇性抑制變得困難?？此铺囟ǖ谋硇蛯?shí)際上可能是由幾種相關(guān)酶的同時調(diào)節(jié)所導(dǎo)致的。

例如：

Cat：IS1270 SP600125

廣泛使用的 JNK 抑制劑 SP600125還能有效抑制 PI3Kδ 和 S6K1，從而在免疫細(xì)胞研究中容易引入錯誤研究結(jié)果。

SP600125

2. 小分子化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)驅(qū)動的多效性

某些化學(xué)基團(tuán)會促進(jìn)非特異性結(jié)合。疏水基團(tuán)、芳香環(huán)和帶電基團(tuán)能夠與脂質(zhì)膜或血清蛋白相互作用，從而改變細(xì)胞內(nèi)有效濃度。計(jì)算得出的 LogP 值（脂溶性）較高的化合物尤其容易聚集和非特異性地與蛋白質(zhì)結(jié)合。

Cat：IC3910  Clofazimine

Clofazimine具有多環(huán)芳香共軛體系和氯原子取代的強(qiáng)疏水骨架，LogP值高，使其極易與脂質(zhì)膜和血清蛋白發(fā)生非特異性結(jié)合。

Clofazimine

3. 濃度依賴性選擇性

選擇性并非一種絕對的固有屬性；相反，它與濃度密切相關(guān)。在 10 nM 時極其具有選擇性的化合物，在 10 µM 時可能會抑制數(shù)十種非靶點(diǎn)。許多研究人員在不知情的情況下使用了濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出其選擇性范圍的抑制劑，無意中引入了干擾性作用。

Cat：IA1740  Aliertib

Aliertib在nM下是高度選擇性的Aurora A激酶抑制劑，但在μM 水平下會脫靶抑制多種其他激酶（如 FLT3）或影響細(xì)胞周期相關(guān)蛋白。

Aliertib

脫靶效應(yīng)如何破壞實(shí)驗(yàn)有效性？

脫靶效應(yīng)很少會“自我宣告"。相反，它們會通過以下幾種方式悄無聲息地扭曲數(shù)據(jù)解讀。

細(xì)胞學(xué)檢測中的假陽性表型

活性小分子化合物可能通過線粒體毒性而非其預(yù)期靶點(diǎn)來降低細(xì)胞活力。細(xì)胞的形態(tài)變化也可能源于與研究通路無關(guān)的細(xì)胞骨架破壞。

檢測方法干擾

某些活性化合物會直接干擾檢測化學(xué)體系，從而導(dǎo)致得到錯誤的數(shù)據(jù)理論，影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)展。

Cat：IR1380 刃天青鈉

基于刃天青的細(xì)胞活力檢測易受具有氧化還原活性的化合物影響，這些化合物無論細(xì)胞代謝狀態(tài)如何，都能直接還原該染料。

刃天青鈉

作用機(jī)制的錯誤歸屬

在沒有進(jìn)行嚴(yán)格的脫靶分析的情況下，研究人員可能會錯誤地將某一表型歸因于特定的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用或信號節(jié)點(diǎn)，從而導(dǎo)致后續(xù)研究工作的浪費(fèi)以及不正確的生物學(xué)模型建立。

如何識破脫靶效應(yīng)？

早期發(fā)現(xiàn)脫靶效應(yīng)可以節(jié)省大量的后期工作，以下方法可以用來識別脫靶效應(yīng)。

01

劑量-反應(yīng)曲線（Dose-Response）

陡峭的、閾值依賴性的反應(yīng)通常表明化合物結(jié)合了單個高親和力靶點(diǎn)。相反，在寬濃度范圍內(nèi)出現(xiàn)的平緩、廣譜反應(yīng)則可能提示多藥理作用。在選定工作濃度之前，務(wù)必先建立完整的劑量-反應(yīng)曲線。

02

正交驗(yàn)證（Orthogonal Validation）

單一檢測方法不足以確立化合物的靶向作用機(jī)制。應(yīng)至少采用兩種機(jī)制上相互正交的檢測策略進(jìn)行交叉驗(yàn)證。

基因水平正交驗(yàn)證

·多組 sgRNA/shRNA交叉敲低

針對同一靶基因設(shè)計(jì) 3 條及以上 不同序列的 sgRNA 或 shRNA。若僅其中 1 條產(chǎn)生表型，而其余均無一致表型，則可判定該表型極大概率源于脫靶效應(yīng)。

·CRISPR 敲除 + RNA 干擾雙重驗(yàn)證

聯(lián)合使用 CRISPR 介導(dǎo)的基因敲除（DNA 水平）與慢病毒 shRNA 介導(dǎo)的基因敲低（RNA 水平）。若兩種方法所得表型不一致，提示存在脫靶效應(yīng)。

·全基因組脫靶測序（CIRCLE-seq / Digenome-seq）

在體外及細(xì)胞內(nèi)水平高通量掃描全基因組潛在錯配切割位點(diǎn)，直接定位脫靶基因，是目前公-認(rèn)的“金標(biāo)準(zhǔn)"正交驗(yàn)證方法。

·轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）差異基因比對

比較干預(yù)組（藥物或基因操作）與對照組的轉(zhuǎn)錄組差異，排除非目標(biāo)通路的異常激活，從而系統(tǒng)篩查大范圍的脫靶表達(dá)擾動。

蛋白/功能水平正交驗(yàn)證

·靶點(diǎn)抑制劑 + 基因敲除雙向?qū)φ?/strong>

比較小分子抑制劑處理與靶基因純合敲除后的生物學(xué)表型及功能指標(biāo)。若兩者結(jié)果不一致，則提示該藥物存在顯著脫靶作用。

·靶點(diǎn)過表達(dá)回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)

在敲低或敲除靶基因后，回補(bǔ)一個對原干預(yù)方式不敏感的耐藥型靶基因突變體。若表型未能恢復(fù)，則說明觀察到的效應(yīng)來源于脫靶，而非靶點(diǎn)本身。

·同源蛋白家族交叉活性檢測

細(xì)胞與表型正交驗(yàn)證

·不同細(xì)胞系平行驗(yàn)證

在野生型細(xì)胞、靶基因缺失型細(xì)胞及同源基因高表達(dá)細(xì)胞中同步開展實(shí)驗(yàn)。若表型在不同細(xì)胞系間差異過大，可判定存在脫靶效應(yīng)。

·陰性對照細(xì)胞株驗(yàn)證

使用靶基因純合敲除的細(xì)胞株進(jìn)行藥物處理。若該細(xì)胞仍出現(xiàn)明顯的藥效或表型，則直接證明該藥物存在較強(qiáng)的脫靶效應(yīng)。

·濃度梯度效應(yīng)擬合

通過高低不同濃度梯度檢測功能響應(yīng)曲線。若在低濃度下觀察到靶向起效，而在高濃度下出現(xiàn)異常表型，則提示高濃度易誘發(fā)脫靶效應(yīng)。

如何控制脫靶效應(yīng)？

一旦識別出脫靶效應(yīng)，可采用以下策略進(jìn)行控制脫靶效應(yīng)。

 使用多種結(jié)構(gòu)不同的抑制劑

不應(yīng)僅依賴任何一種單一的抑制劑。使用兩種或以上具有不同骨架但靶向同一蛋白的抑制劑，可以大大降低共享脫靶假象的風(fēng)險。

例如：

在進(jìn)行BTK相關(guān)研究時，建議將Evobrutinib（CAS: 1415823-73-2）與Acalabrutinib（CAS: 1420477-60-6）或Zanubrutinib（CAS: 1691249-45-2）聯(lián)合使用，通過表型一致性驗(yàn)證以增強(qiáng)結(jié)論的可靠性。

Cat：IE1230  Evobrutinib

Cat：IA0780  Acalabrutinib

Cat：IZ0570  zanubrutinib

 設(shè)置陰性對照化合物

應(yīng)采用無活性的結(jié)構(gòu)類似物或立體異構(gòu)體作為陰性對照。

例如：

在驗(yàn)證EGFR依賴性表型時，不應(yīng)僅依賴單一抑制劑。建議聯(lián)用兩種具有不同骨架和作用機(jī)制的抑制劑：共價（不可逆）EGFR抑制劑Osimertinib（CAS: 1421373-65-0，嘧啶骨架，靶向T790M突變）與可逆性EGFR抑制劑Gefitinib（CAS: 184475-35-2，喹唑啉骨架）。若兩種抑制劑能產(chǎn)生一致的表型效應(yīng)，則可更有力地證明該效應(yīng)源于對EGFR靶點(diǎn)的特異性作用，而非共同的脫靶效應(yīng)。

Cat：IO0820 Osimertinib

Cat：IG0060 Gefitinib

 開展洗脫實(shí)驗(yàn)

若表型在化合物去除后可逆轉(zhuǎn)，則支持該化合物通過直接、可逆的方式與靶點(diǎn)結(jié)合。若洗脫后效應(yīng)仍持續(xù)存在，則提示可能由細(xì)胞毒性或不可逆的脫靶修飾所導(dǎo)致。

 優(yōu)化給藥方案

務(wù)必在已確認(rèn)的選擇性窗口內(nèi)進(jìn)行劑量設(shè)計(jì)。應(yīng)確定最-低有效濃度（MEC），避免默認(rèn)使用高微摩爾濃度的劑量。條件允許時，建議采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）測定細(xì)胞內(nèi)化合物水平以進(jìn)行確認(rèn)。

高選擇性小分子化合物

下表列出了經(jīng)過文獻(xiàn)驗(yàn)證、具有高選擇性的小分子抑制劑，適用于精確的信號通路解析。