Caspase-6活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書

比色法

貨號(hào)：BC3860

規(guī)格：20T、50T、100T

產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑一：分裝-20℃保存。

2、 試劑二：分裝-20℃保存。

3、 標(biāo)準(zhǔn)品：pNA標(biāo)準(zhǔn)溶液，5 mmol/L。標(biāo)準(zhǔn)溶液在4℃條件下為渾濁狀態(tài)，溶解即可變?yōu)槌吻鍫顟B(tài)，不影響使用。

4、 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液配制：取9 mL試劑一加入1 mL試劑二，充分混勻待用。（也可按照試劑一：試劑二=9:1的比例，自行配制）。

產(chǎn)品說(shuō)明：

Caspase是參與細(xì)胞凋亡過(guò)程的蛋白酶家族，包含10多個(gè)成員。Caspase-6也稱Mch-2，其前體蛋白被granzyme B剪切后形成活化的caspase-6二聚體，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Caspase-6可剪切凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白PARP，剪切核膜上關(guān)鍵蛋白Lamin A，其對(duì)于Lamin A的識(shí)別位點(diǎn)是VEID。

本試劑盒測(cè)定原理基于Caspase-6特異水解其多肽底物Ac-VEID-pNA (N-acetyl-Val-Glu-Ile-Asp-p-nitroanilide)，釋放出游離的硝基苯胺pNA，后者呈黃色在405 nm具有最大吸收峰，采用可見(jiàn)光光度比色法測(cè)定。其吸光度值對(duì)應(yīng)于Caspase-6的水解活性。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、100μL玻璃比色皿/96孔板、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、可調(diào)式移液器、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1、培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)胞數(shù)量（約10⁶個(gè)）加100 μL試劑二（若裂解不充分可提高至150-200 μL），震蕩重懸沉淀，置冰上靜置15 min，4℃，15000g離心10-15min，取上清置冰上待測(cè)。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑二體積（mL）為1：5~10的比例（建議稱取約0.1 g組織，加入1 mL試劑二），冰浴研磨或充分剪碎，置冰上靜置15 min，4℃，15000g離心10-15min，取上清置冰上待測(cè)。 

二、測(cè)定步驟

1、 可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至405nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 臨用前用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液將5 mmol/L pNA標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至200、100、50、25、12.5、0μmol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液待用。

3、 樣本測(cè)定（在96孔板/EP管中按順序加入以下試劑）

三、Caspase-6活性計(jì)算

1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的濃度（x，μmol/L）和ΔA標(biāo)準(zhǔn)（y，減去濃度為0的空白管）做標(biāo)準(zhǔn)方程。將ΔA測(cè)定代入標(biāo)準(zhǔn)方程得到x（μmol/L）。

2. 按酶活性增加百分比計(jì)算

Caspase-6活性增加百分比=（實(shí)驗(yàn)處理組A測(cè)定-A空白管）/（實(shí)驗(yàn)對(duì)照組A測(cè)定-A空白管）×100%

該方法簡(jiǎn)單可靠，可粗略反應(yīng)酶活性情況。

3. 按酶活計(jì)算

參考Chemicon公司的caspase酶活力單位的定義：One unit is the amount of enzyme that will cleave 1.0 nmol of the colorimetric pNA-substrate per hour at 37℃ under saturated substrate concentrations。即一個(gè)酶活力單位定義為當(dāng)?shù)孜镲柡蜁r(shí)，在37℃一個(gè)小時(shí)內(nèi)可以剪切1nmol pNA底物產(chǎn)生1nmol游離 pNA的酶量。這樣就可以計(jì)算出樣品中含有多少個(gè)酶活力單位的caspase酶活性。

Caspase-6活性（U/mg prot）=x×V反總÷（V樣×Cpr）÷T×10³=2x÷Cpr÷T

V反總：反應(yīng)體系總體積，0.1mL=10^-4L；V樣：加入的樣本體積，0.05mL；T：反應(yīng)時(shí)間，h；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；10³：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)，1μmol =10³nmol。

注意事項(xiàng)：

1、由于試劑二中含有還原劑（DTT），建議將樣品用水稀釋2倍后，用Bradford法測(cè)定蛋白濃度，以降低DTT對(duì)蛋白濃度測(cè)定的干擾。不建議使用BCA法測(cè)定蛋白濃度。

2、Caspase活性測(cè)定值低最常見(jiàn)的原因是細(xì)胞未發(fā)生凋亡或細(xì)胞量太少，其次是觀測(cè)時(shí)間不恰當(dāng)。誘導(dǎo)凋亡時(shí)，并非劑量越大時(shí)間越長(zhǎng)Caspase活性就越高。建議設(shè)置不同劑量和時(shí)間點(diǎn)如0、2、4、8、16、24小時(shí)，以檢測(cè)最佳的觀察點(diǎn)。

3、所測(cè)樣本的值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，可用試劑二稀釋樣本后重新測(cè)定。

4、蓋緊96孔板蓋子并用封口膜密封。37 oC孵育，肉眼可見(jiàn)顏色變黃時(shí)的OD405值約為0.2，此時(shí)即可測(cè)定。顏色變化不明顯可延長(zhǎng)反應(yīng)或過(guò)夜，但酶活性較強(qiáng)時(shí)，孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)將導(dǎo)致反應(yīng)失去線性關(guān)系。

參考文獻(xiàn)：

[1] Cohen GM. Caspases: the executioners of apoptosis. Biochem J, 1997, 326: 1-16.

[2] Janicke R U, Sprengart M L, Wati M R, et al. Emerging role of caspase-3 in apoptosis[J]. Cell Death and Differentiation, 1999, 6:99-104.

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