酮體含量檢測試劑盒（血清、血漿、尿液等）說明書

紫外分光光度法

貨號：BC5060

規(guī)格：50T/48S

產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑二A液：臨用前取一支加入1.2mL蒸餾水，充分溶解。用不完的試劑分裝后-20℃可保存3周。避免反復(fù)凍融；

2、 試劑二B液：臨用前取一支加入600μL蒸餾水，充分溶解。用不完的試劑分裝后-20℃可保存3周。避免反復(fù)凍融；

3、 試劑三：臨用前取一支加入400μL蒸餾水，充分溶解。用不完的試劑分裝后-20℃保存，可以保存3周。避免反復(fù)凍融；

4、 標(biāo)準(zhǔn)品1：8mg 3-羥基丁酸鈉。臨用前加入0.98mL蒸餾水，充分溶解，即8mg/mL 3-羥基丁酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液，2-8℃可以保存4周。臨用前根據(jù)試驗所需量用蒸餾水稀釋成0.2mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液待用，即為標(biāo)準(zhǔn)溶液1；

5、 標(biāo)準(zhǔn)品2：8mg乙酰乙酸鋰。臨用前加入0.95mL蒸餾水，充分溶解，即8mg/mL乙酰乙酸鋰標(biāo)準(zhǔn)溶液，-20℃可以保存4周。臨用前根據(jù)試驗所需量用蒸餾水稀釋成0.05mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液待用，即標(biāo)準(zhǔn)溶液2；

6、 BOH工作液配制：臨用前根據(jù)試驗所需量將試劑一A液、試劑二A液 、試劑三按照850μL:40μL:10μL（共900μL，1T的量）的比例配成工作液，充分混勻，置于37℃保溫15min（此步驟不可省略），現(xiàn)用現(xiàn)配，工作液在4h內(nèi)用完；

7、 AcAc工作液配制：臨用前根據(jù)試驗所需量將試劑一B液、試劑二B液、試劑三按照870μL:20μL:10μL（共900μL，1T的量）的比例配成工作液，充分混勻，置于37℃保溫15min（此步驟不可省略），現(xiàn)用現(xiàn)配，工作液在4h內(nèi)用完。

產(chǎn)品說明：

酮體是肝臟脂肪酸氧化分解的中間產(chǎn)物乙酰乙酸（AcAc）、β-羥丁酸（BOH）及丙 酮三者統(tǒng)稱。酮體中丙 酮的生成量相當(dāng)小，生成后即被吸收。乙酰乙酸和β-羥丁酸則經(jīng)血流進(jìn)入肝外組織，在此被氧化，經(jīng)檸檬酸循環(huán)提供更多能量給那些組織使用，例如骨、心肌和腎皮質(zhì)。

在pH 7.0和37℃條件下，BOH在β-羥丁酸脫氫酶（HBDH）催化下脫氫生成乙酞乙酸，同時NAD⁺被還原成NADH；在pH 8.8和37℃條件下，AcAc被HBDH還原為3-羥基丁酸酯或脫羧生成丙 酮，同時NADH被氧化成NAD⁺，NADH在340nm波長下有特征吸收峰，通過檢測在340nm波長下的吸光值變化可以計算出BOH和AcAc的含量，從而計算出樣本中酮體的含量。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計、低溫離心機(jī)、可調(diào)式移液器、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、1mL石英比色皿、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

血清（漿）、尿液等液體樣本：直接測定。（若有渾濁可以離心取上清后測定）

二、測定步驟

1、 紫外分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，用蒸餾水調(diào)零。

2、 BOH含量測定：

3、 AcAc含量測定：

三、酮體含量計算

1、 BOH計算公式

BOH含量（μmol/mL）=(ΔA_BOH樣本-ΔA_BOH空白)÷(ΔA_{BOH標(biāo)準(zhǔn)}-ΔA_BOH空白)×C_BOH÷126.09×1000

=1.586×(ΔA_BOH樣本-ΔA_BOH空白)÷(ΔA_{BOH標(biāo)準(zhǔn)}-ΔA_BOH空白)

2、 AcAc計算公式

AcAc含量（μmol/mL）=(ΔA_AcAc樣本-ΔA_AcAc空白)÷(ΔA_{AcAc標(biāo)準(zhǔn)}-ΔA_AcAc空白)×C_AcAc÷108.02×1000

=0.463×(ΔA_AcAc樣本-ΔA_AcAc空白)÷(ΔA_{AcAc標(biāo)準(zhǔn)}-ΔA_AcAc空白)

3、 酮體計算公式

酮體含量（μmol/mL）= BOH含量+ AcAc含量

C_BOH：BOH標(biāo)準(zhǔn)溶液1濃度，0.2mg/mL；C_AcAc：AcAc標(biāo)準(zhǔn)溶液2濃度，0.05mg/mL；126.09：3-羥基丁酸鈉的分子量，126.09mg/mmol；108.02：乙酰乙酸鋰的分子量，108.02mg/mmol；1000：單位換算系數(shù)，1mmol= 1000μmol。

注意事項：

1. 如果測定初始吸光值＞1.5或ΔA＞0.2，建議將樣本用蒸餾水稀釋后再測定。計算公式中乘上稀釋倍數(shù)；

2. 如果ΔA接近空白值，建議加大樣本量，同時保證反應(yīng)體系總體積不變，相應(yīng)減少工作液加樣量后測定。例如，若增大樣本量為200μL，則工作液調(diào)整為800μL。標(biāo)準(zhǔn)管與樣本管加樣體系應(yīng)保持一致，計算公式不變。

實驗實例：

取100μL牛血清按上述步驟進(jìn)行實驗，用1mL石英比色皿測定后進(jìn)行計算ΔA_BOH樣本=A_BOH樣本2-A_BOH樣本1= 0.095-0.056=0.039，ΔA_{BOH標(biāo)準(zhǔn)}=A_{BOH標(biāo)準(zhǔn)2}-A_{BOH標(biāo)準(zhǔn)1}=0.175-0.024=0.151，ΔA_BOH空白=A_BOH空白2-A_BOH空白1= 0.008-0.005=0.003，ΔA_AcAc樣本=A_AcAc樣本1-A_AcAc樣本2=0.639-0.634=0.005，ΔA_{AcAc標(biāo)準(zhǔn)}=A_{AcAc標(biāo)準(zhǔn)1}-A_{AcAc標(biāo)準(zhǔn)2}= 0.586-0.447=0.139，ΔA_AcAc空白=A_AcAc空白1-A_AcAc空白2=0.696-0.695=0.001。計算
  BOH含量（μmol/mL）=1.586×(ΔA_BOH樣本-ΔA_BOH空白)÷(ΔA_{BOH標(biāo)準(zhǔn)}-ΔA_BOH空白)=0.369μmol/mL

AcAc含量（μmol/mL）=0.463×(ΔA_AcAc樣本-ΔA_AcAc空白)÷(ΔA_{AcAc標(biāo)準(zhǔn)}-ΔA_AcAc空白)=0.0134μmol/mL

酮體含量（μmol/mL）= BOH含量+ AcAc含量=0.383μmol/mL。

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